Projekt-Zusammenfassung
Ziel dieser Arbeitsgruppe ist die Entwicklung und Optimierung eines neuartigen Glaskörperersatz auf Hydrogel-Basis, welcher genügend Festigkeit, Stabilität, Viskosität und Quelldruck aufweist, um eine ausreichende Tamponade im Glaskörperraum zu gewähren. Neben guten Tamponade-, rheologischen und optischen Eigenschaften soll das Glaskörperäquivalent gleichzeitig als Trägermatrix zur verzögerten Medikamentenfreisetzung dienen. Derzeit werden die ersten Funktionsmuster in präklinischen Studien getestet.

Die Tamponadewirkung von hydrophoben Endotamponaden (links) im Vergleich zum neu entwickelten Hydrogel-Glaskörperersatz (rechts). Während links keine vollständige Tamponade erreicht werden kann und sich Wachstumsfaktoren unterhalb der Tamponade konzentrieren und so proliferative Prozesse befördern, kann ein natürlicher Glaskörperersatz eine volle Tamponade erreichen und sich dennoch in die natürliche Homöostase einfügen.

Klinischer Hintergrund
Die Behandlung komplizierter Netzhaut- und Glaskörpererkrankungen ist eine der zentralen Herausforderungen in der operativen Augenheilkunde. Im Rahmen der Standardtherapie wird der natürliche Glaskörper entfernt (Vitrektomie) und die Netzhaut mit einer temporären Tamponade stabilisiert. Trotz wesentlicher technologischer Innovationen löst die pars-plana-Vitrektomie in Kombination mit Endotamponaden nicht alle Probleme der Ablatiochirurgie. Auch modernste Tamponadematerialien bieten keine zufriedenstellende Antwort auf Mehrlochsituationen an unterschiedlichen Stellen, die Problematik der proliferativen Vitreoretinopathie (PVR) oder die persistierende Hypotonie.

Warum sind bestehende Standardtherapien nicht ausreichend?
Bisherige Tamponaden sind in ihren Materialeigenschaften hydrophob (Gase, Öle, semifluorierte Alkane) und üben ihre tamponierenden Eigenschaften über Auftriebsvektor und Oberflächenspannung aus. Obwohl das in der klinischen Anwendung durchaus erfolgreich ist, birgt der hydrophobe Charakter auch deutliche Nachteile, die beispielsweise die PVR-Entwicklung eher fördern als hemmen. Hydrophobe Tamponaden sind aus folgenden Gründen in ihrer Wirkung limitiert, weil
(1) keine vollständige Tamponade erreicht werden kann,
(2) keine gleichmäßige Tamponade aller Netzhautanteile erreicht wird,
(3) PVR nicht verhindert wird.
Die Tamponade-Wirkung weicht auch völlig von den Eigenschaften des natürlichen Glaskörpers, der als Komposit-Hydrogel hydrophil ist und so eine gleichmäßige Andruckwirkung erzielt.

Zielsetzung
Wünschenswert im Sinne einer idealen Tamponade wäre ein Glaskörperersatz, der dem natürlichen Glaskörper nachempfunden ist, also seine tamponierende Wirkung eher durch Quelldruck und Viskosität ausübt. Moderne Hydrogele zeigen eine gute, Quelldruck-vermittelte Tamponadewirkung bei gleichzeitig sehr guten optischen Eigenschaften. Verschiedene Ansätze erstrecken sich vorwiegend auf den Einsatz quervernetzter semisynthetischer oder vollsynthetischer Polymere. Diese Hydrogele besitzen nicht nur ausgezeichnete refraktive und rheologische Eigenschaften sowie eine hervorragende Biokompatibilität, sondern wirken zusätzlich antiadhäsiv und antimigrativ. Dadurch ließen sich PVR Reaktionen alleine durch die Hydrogel-Tamponade reduzieren. Die zusätzliche Möglichkeit einer kontrollierten Medikamentenfreisetzung durch entsprechend beladene Hydrogele kann weitere antiproliferative, neuroprotektive oder nutritive Funktionen erfüllen.

Wie ist der Projektstand?
Im Jahr 2002 wurde ein Tissue Engineering-Labor zur Entwicklung eines künstlichen Glaskörperäquivalentes eingerichtet. Das Projekt wird seit Beginn über Stiftungszuwendungen, ein Fellowship-Projekt der Europäischen Union und der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert. Über die Projektförderungen konnten wir in der Forschungsgruppe mehrere Doktoranden, Post-Doktoranden und ausländische Stipendiaten integrieren. Inzwischen wurden mehrere Glaskörper-Äquivalente auf Hydrogel-Basis (quervernetzte Glycosaminoglykane) entwickelt und als Medikamententräger zur verzögerten Freisetzung antiproliferativ wirksamer Medikamente optimiert. Wir konnten zeigen, dass unser Glaskörperersatz auf Hydrogel-Basis eine hervorragende Langzeit-Stabilität und -Verträglichkeit hat. Die neuesten Entwicklungen scheinen sogar die Kataraktprogression nach einer Vitrektomie zu verzögern. Zukünftige Entwicklungen von Hydrogel-Tamponaden werden auch die Bedeutung des Glaskörperkortex einbeziehen. Derzeit laufen die ersten präklinischen Studien unter Aufsicht der Ethikkommission Saarbrücken.

Prototypen des neuen Glaskörperersatz auf Hydrogel-Basis. Es kann über 23gauge injiziert werden und erhält sich dennoch eine ausreichende Steifigkeit für hochwertige Tamponade-Eigenschaften

Wie sind wir methodisch aufgestellt?
Zellkulturtechniken mit Proliferations- und Toxizitäts-Assays, Immunfluoreszenz-Aufarbeitung histologischer Gewebeschnitte, Antikörper-Assays, Partikelgrößenmessung, Photometrische Konzentrationsmessung in Gewebe, HPLC, Western-Blot, FACS-Analyse, Gewebepräparation mit Materialgewinnung und Zellzählung und Spezialfärbungen, in-vivo Versuche operativ mit Langzeitbeobachtung (Vitreoretinale Operationseinheit entsprechend Augen-OP, Foto, Spaltlampe, Augendruckmessung), Elektrophysiologische Untersuchungseinheit

Das Projektteam
Prof. Dr. med. Peter Szurman (Arbeitsgruppenleiter)
Prof. Dr. med. Kai Januschowski

Projekt-Zusammenfassung
Ziel dieser Arbeitsgruppe ist die Entwicklung von künstlichen Geweben und Biogrenzflächen, welche sowohl das Verständnis als auch die Therapie von Augenkrankheiten mit dem Schwerpunkt vitreoretinale und korneale Krankheitsbilder fördern sollen.

Klinischer Hintergrund
In den frühen 1990er Jahren entstand mit dem Tissue Engineering (engl. für Gewebezüchtung) ein interdisziplinärer Teilbereich der regenerativen Medizin, der darauf abzielt, die Funktion eines biologischen Gewebes wiederherzustellen, zu erhalten oder zu verbessern. Durch die gezielte Kombination von Zellen und bioaktiven Stoffen (z.B. Wachstumsfaktoren) mit einem Biomaterial als strukturellem Gerüst können künstliche Gewebe entstehen, die sich nach der Implantation im menschlichen Körper integrieren und den Heilungsprozess fördern. Das Auge bietet mit seinen unterschiedlichen Strukturen, Zelltypen und Geweben eine Vielzahl Tissue-Engineering-relevanter Herausforderungen. Aufgrund altersbedingter Degenerationsprozesse und verschiedener Krankheitsverläufe kann es zu auftretenden Fehlfunktionen des okularen Gewebes mit dem Risiko von schweren Sehbehinderungen bis hin zur Erblindung kommen. Einen geeigneten Therapieansatz stellt die Transplantation von natürlichen (Teil-)Geweben oder artifiziellen Ersatzstoffen dar.

In der Augenheilkunde besteht insbesondere ein hoher Bedarf an geeigneten Ersatzmaterialien für die Hornhaut, die Linse und den Glaskörper. Bei der Hornhauttransplantation werden beschädigte oder erkrankte Hornhäute durch gespendetes Hornhautgewebe ganz (perforierende Keratoplastik) oder teilweise (lamellare Keratoplastik) ersetzt. Hinzu kommen über 20 Mio. Katarakt-Operationen weltweit, bei der die getrübte Linse abgesaugt und durch eine starre Kunstlinse ersetzt wird. Nicht zuletzt erfordert die Therapie von komplizierten Netzhaut- und Glaskörpererkrankungen das chirurgische Entfernen des natürlichen Glaskörpers (Vitrektomie) und einen geeigneten Ersatz des Gewebes.

Warum sind bestehende Standardtherapien nicht ausreichend?
Eine der größten Herausforderungen, vor der das Tissue Engineering bis heute steht, ist die notwendige komplexe Funktionalität eines Gewebes und dessen gezielte Integration in den menschlichen Körper. Die Anfänge der regenerativen Medizin zeigten, dass der Einsatz von rein synthetischen Materialien häufig mit der Gefahr von Fremdkörperreaktionen verbunden war, die zu beschwerlichem Implantat-Versagen sowie zu Entzündungs- und Abstoßungsreaktionen führten. Die gestörten Wundheilungsprozesse und Infektionen können zudem zur Ausbildung von Narben führen, die die Sehfähigkeit einschränken. Um die Verträglichkeit der Implantate zu verbessern, gewannen zunehmend Konzepte an Bedeutung, die bioaktive oder körpereigene Materialien integrierten. So sollen Biomaterialien und lebende Zellen die Biokompatibilität, Funktionalität und Stabilität des Implantats erhöhen und dessen erfolgreichen Einsatz zur Regeneration von Körperfunktionen langfristig sichern.

Trotz der medizinischen Fortschritte der letzten Jahre verdeutlichen der Anstieg der altersbedingten Erblindungen und der bestehende Mangel an Gewebespenden den Bedarf an alternativen Behandlungsmethoden. Am Beispiel der Hornhauttransplantationen ist die Zahl der geeigneten Transplantate durch Faktoren wie Vernarbungen und geringe Endothelzellzahlen, Haltbarkeit und positive virologische oder mikrobiologische Befunde der Transplantate limitiert. Bestehende Ansätze zur Entwicklung von künstlichen Hornhautgeweben sind zum einen durch die mangelnde Bioverträglichkeit, Geometrie und Stabilität der Gerüststrukturen und zum anderen durch die ungenügende Integration und Funktionalität der verschiedenen Hornhautzellen eingeschränkt. Mit Blick auf die Behandlung eines Katarakts ist zu beanstanden, dass bei einer Graue-Star-Operation zwar die Sehkraft wiederhergestellt wird, jedoch nicht die Akkomodation (Naheinstellung). Zusätzlich muss eine Vielzahl der behandelten Patienten aufgrund einer proliferierenden, trüben Zellschicht hinter dem Linsenimplantat (Nachstar) für eine zweite Operation vorstellig werden. Auch die bestehenden Ersatzstrategien für den entfernten, natürlichen Glaskörper nach Netzhaut- und Glaskörperoperationen sind durch den Einsatz von hydrophoben Ölen, Gasen oder Perfluorcarbenen unzureichend, da Komplikationen wie Emulsifikationen, Kataraktbildung und die Notwendigkeit einer zusätzlichen operativen Entfernung resultieren können.

Zielsetzung
Durch die Kombination von Zellen, Biomaterialien und bioaktiven Stoffen wie Wachstums- und Differenzierungsfaktoren sollen mit Blick auf die klinische Anwendung gezielt neue regenerative Behandlungsstrategien entwickelt werden:

• Entwicklung der weltweit ersten Tamponade für die Netzhautchirurgie auf Basis eines Hydrogels, welche die natürlichen Eigenschaften des gesunden Glaskörpers nachbildet. Der aktuelle materialbasierte Entwicklungsstand soll durch Inklusion von Zellen und/oder Zellprodukten um die Ebene des Tissue Engineerings erweitert werden.
• Entwicklung einer echten akkommodierenden Linse auf Basis eines flexiblen biokompatiblen Hydrogels, mit dem der Kapselsack nach Femtosekunden-laser-gestützter Linsenentfernung wieder aufgefüllt werden soll.
• Entwicklung eines transplantierbaren bioresorbierbaren Trägersheets mit kultivierten autologen oder hiPSC-abgeleiteten Limbusstammzellen zur Behandlung von Patienten mit Hornhautblindheit aufgrund schwerster Verbrennungen/Verätzungen.
• Entwicklung eines dreidimensionalen künstlichen Hornhautkonstrukts mit Rezellularisierung durch autologe oder hiPS-abgeleitete Hornhautzellen sowie die Optimierung der Präparations- und Kultivierungstechniken für künstliche Biomatrix-Konstrukte im Vergleich zu modifizierten Hornhaut-Spenderlamellen.

Über den Erhalt bzw. die Rückgewinnung von funktionellem Gewebe hinausgehend wird darauf abgezielt, das Risiko potentieller Abstoßungs- und Entzündungsreaktionen nach Transplantation zu reduzieren und den Therapieerfolg eines Transplantats langfristig zu sichern. Dazu ist es notwendig, die Biogrenzfläche mit ihren vielfältigen Zell-Matrix-Interaktionen in den fächerübergreifenden Fokus von Medizin, Biologie, Chemie und Materialwissenschaften zu rücken. Das Design von künstlichen Geweben und definierten Biogrenzflächen erfordert dabei ein tiefes Verständnis der komplexen Wechselwirkungen zwischen Material und Zelle, das unter Laborbedingungen außerhalb des Organismus -in-vitro- erlangt werden kann.

Wie ist der Projektstand?
Es besteht langjährige Erfahrung mit der Entwicklung biopolymerer Materialplattformen, insbesondere von Hydrogel-basierten Gerüststrukturen, sowie der Isolation, Kultivierung und Manipulation verschiedenster Zellen für das Tissue Engineering. Kritische Materialeigenschaften zur Herstellung biomimetischer Systeme wurden definiert und tiefergehend untersucht. Studien zum Einfluss der Materialoberfläche und von Proteinen auf die Biogrenzfläche lieferten Erkenntnisse zur gezielten Kontrolle und Steuerung von Zellfunktionen. In in-vitro-Studien wurden erste, vielversprechende Materialsysteme getestet, mit Zellen besiedelt und die resultierenden Zell-Matrix-Kontakte analysiert. Die Evaluation der Prototypen in-vivo wird zur Zeit weiter vorangetrieben.

• Extraktion und Präparation von Geweben
• Toxizitäts-Assays
• Synthese und Modifikation artifizieller Gerüststrukturen
• Biochemische Dezellularisierung von tierischem Gewebe
• Bestimmung physikochemischer Materialeigenschaften (Benetzbarkeit, Ladung, Rauigkeit, Topografie, Stabilität/Degradation, Porosität, rheologische und mechanische Charakteristika)
• Analyse der Proteinadsorption (Quantität, Stabilität, Faltungsprozesse)
• Zellkulturtechniken mit Adhäsions-, Proliferations-, Migrations- und Differenzierungs-Assays
• Histologische Gewebsschnitte
• Molekularbiologische Assays (qPCR)
• Immunologische Methoden (ELISA, Immunfluoreszenz, FACS, Western Blot)
• Vitreoretinale Operationseinheit (Funduskopie, OCT, Augendruckmessung)
• Elektrophysiologische Untersuchungseinheit (ERG)
  
  

Das Projektteam
Dr. rer. nat. André Schulz (Arbeitsgruppenleiter)
Dr. med. Annekatrin Rickmann
Dr. rer. nat. Silke Wahl
Dr. rer. nat. Henrike Julich-Härtel
Prof. Dr. med. Kai Januschowski
Prof. Dr. med. Peter Szurman

Kooperationspartner
Fraunhofer-Institut für Biomedizinische Technik IBMT

Schlüsselpublikationen

• • Schulz A, Rickmann A, Wahl S, Germann A, Stanzel B V, Januschowski K, Szurman P (2020). Alginate-and hyaluronic acid–based hydrogels as vitreous substitutes: An in vitro evaluation. Transl. Vis. Sci. Techn., 9(13): 34.
  • Schulz A, Rickmann A, Julich‐Haertel H, Germann A, von Briesen H, Januschowski K, Szurman P (2020). Comparative cytotoxic and antiproliferative profile of methotrexate and fluorouracil on different ocular cells. Acta Ophthalmologica.
  • Schulz A, Wahl S, Rickmann A, Ludwig J, Stanzel BV, von Briesen H, Szurman P (2019): Age-related loss of human vitreal viscoelasticity. Transl. Vis. Sci. Techn., 8(3): 56.
  • Schramm C, Spitzer MS, Henke-Fahle S, Steinmetz G, Januschowski K, Heiduschka P, Geis-Gerstorfer J, Biedermann T, Bartz-Schmidt KU, Szurman P (2012): The crosslinked biopolymer hyaluronic acid as an artificial vitreous substitute. Invest Ophth Vis Sci, 53 (2), 613-621.
  • Schulz A, Gepp MM, Stracke F, von Briesen H, Neubauer JC, Zimmermann H (2019): Tyramine-conjugated alginate surfaces as a platform for bioactive scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A., 107(1): 114-121.
  • Schulz A, Katsen-Globa A, Huber EJ, Mueller SC, Kreiner A, Pütz N, Gepp MM, Fischer B, Stracke F, von Briesen H, Neubauer JC, Zimmermann H (2018): Poly(amidoamine)-alginate hydrogels: Directing the behavior of mesenchymal stem cells with charged hydrogel surfaces. J. Mater. Sci. Mater. Med., 29: 105.
  • Yoeruek E, Bayyoud T, Maurus C, Homann J, Spitzer MS, Bartz-Schmidt KU, Szurman P (2012): Decellularization of porcine corneas and repopulation with human corneal cells for tissue-engineered xenografts. Acta Ophthalmologica, 90(2): 125-131.